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Aug 31, 2023

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 3692 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Echtzeitüberwachung des SARS-CoV-2-Virus in der Luft stellt eine technologische Lücke dar, die der wissenschaftlichen Gemeinschaft seit Beginn der COVID-19-Pandemie entgangen ist. Offline-Luftprobenahmetechniken zum Nachweis von SARS-CoV-2 haben mit längeren Durchlaufzeiten zu kämpfen und erfordern qualifizierte Arbeitskräfte. Hier präsentieren wir einen Proof-of-Concept-Monitor für die Luftqualität von Krankheitserregern (pAQ) zur direkten Echtzeiterkennung (5-Minuten-Zeitauflösung) von SARS-CoV-2-Aerosolen. Das System integriert synergistisch einen Nasszyklon-Luftkeimsammler mit hohem Durchfluss (~1000 l/min) und einen ultraempfindlichen Mikroimmunelektroden-Biosensor auf Nanokörperbasis. Der Nasszyklon zeigte eine vergleichbare oder bessere Leistung bei der Virusprobenahme als kommerziell erhältliche Probenehmer. Laborexperimente zeigen eine Geräteempfindlichkeit von 77–83 % und eine Nachweisgrenze von 7–35 viralen RNA-Kopien/m3 Luft. Unser pAQ-Monitor eignet sich für die Point-of-Need-Überwachung von SARS-CoV-2-Varianten in Innenräumen und kann für den Multiplex-Nachweis anderer relevanter Atemwegserreger angepasst werden. Eine weit verbreitete Einführung einer solchen Technologie könnte den Gesundheitsbehörden bei der Umsetzung schneller Maßnahmen zur Seuchenbekämpfung helfen.

Die im Dezember 2019 begonnene Pandemie der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19) plagt immer noch Länder auf der ganzen Welt. Die Weltgesundheitsorganisation meldete in der ersten Januarwoche 2023 weltweit über 1,7 Millionen neue bestätigte Fälle1. Das schwere akute respiratorische Syndrom Coronavirus 2 (SARS -CoV-2)-Coronavirus verursacht diese Krankheit und wird durch Atemtröpfchen übertragen, die von infizierten Personen beim Husten, Niesen, Atmen und Sprechen ausgestoßen werden. Die Übertragung über die Luft gilt als einer der vorherrschenden Infektionswege2,3, daher die hohe Infektiositätsrate und der virulente Charakter der Krankheit. Um dieser raschen Ausbreitung entgegenzuwirken, haben Regierungen auf der ganzen Welt Richtlinien wie die Maskenpflicht im öffentlichen Raum, die Quarantäne infizierter Personen und soziale Distanzierung eingeführt, um das Risiko einer Übertragung über die Luft zu verringern. Solche Kontrollmaßnahmen wirkten sich jedoch negativ auf das tägliche Leben aus, mit Folgen wie Flugreisebeschränkungen, verminderter körperlicher Aktivität, Einschränkungen bei großen gesellschaftlichen Zusammenkünften und der Schließung von Schulen und Büros. In vielen Ländern dauerte es fast zwei Jahre, bis die normalen Aktivitäten wieder aufgenommen wurden. Die Angst vor einer Ansteckung und das periodische schnelle Wiederaufleben der Krankheit, beispielsweise Ende Dezember 2022 in China4, verdeutlichen jedoch, dass selbst die größten Nationen nicht auf die Bekämpfung der Ausbreitung von Krankheitserregern in der Luft vorbereitet sind. Die Nichtverfügbarkeit schneller und kostengünstiger Infektionserkennungsprotokolle auf Gemeindeebene war für politische Entscheidungsträger ein limitierender Faktor bei der Umsetzung umgehender Strategien zur Eindämmung der COVID-19-Übertragung. Ein nichtinvasives Echtzeitüberwachungsgerät, das SARS-CoV-2-Aerosole direkt in der Luft erkennen kann, ist eine mögliche Lösung für Infektionsmanagementstrategien und die Wiederaufnahme normaler Aktivitäten.

Zur Erkennung von Virusaerosolen werden üblicherweise Offline-Luftprobenahmetechniken eingesetzt, bei denen die Probenentnahme und -analyse in zwei Schritten erfolgt: Zunächst werden die Virusaerosole mit eigenständigen Bioaerosolsammlern gesammelt, anschließend werden die Proben zur weiteren Analyse in ein Labor transportiert. In jüngsten Studien wurden Offline-Luftprobenahmetechniken wie PILS (Condensation Growth Based Particle In Liquid Sampler), PILS auf Basis von Nasswandzyklonen und Filterprobenahme verwendet, gefolgt vom Virusnachweis mittels Reverse Transcription-Quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR). um das Vorhandensein von SARS-CoV-2-RNA in der Luft in Krankenhäusern5,6,7,8,9, Einkaufszentren10, öffentlichen Verkehrsmitteln10, Wohnräumen11 und sogar in der Außenluft12,13 festzustellen. Diese Ergebnisse unterstreichen zwar die Bedeutung einer Überwachungsmethode zum Nachweis luftübertragener Viren zur Kontrolle der Ausbreitung der Infektion, diese Offline-Methoden haben jedoch eine lange Bearbeitungszeit (1–24 Stunden), erfordern qualifizierte Arbeitskräfte und liefern keine Echtzeitinformationen Es ist erforderlich, rasch Maßnahmen zur Bekämpfung der Ausbreitung des Virus in der Luft zu ergreifen.

Nach unserem Kenntnisstand gibt es keine kommerziell erhältlichen automatisierten Echtzeit-Erkennungsgeräte für SARS-CoV-2 in der Luft. Dies ist hauptsächlich auf zwei Technologielücken zurückzuführen: Erstens ist ein effizienter High-Flow-Virus-Aerosol-Probenehmer erforderlich, der in einen Echtzeit-Virusdetektor integriert werden kann. Zweitens besteht Bedarf an einem Virenerkennungsprotokoll, das schnell, genau und empfindlich genug ist, um die geringe Konzentration von Viren zu messen, die normalerweise in der Umgebungsluft vorkommen. Frühere Studien haben gezeigt, dass Probenehmer, die mit hohen Durchflussraten arbeiten, Aerosole aus einem großen Luftvolumen konsolidieren und eine konzentrierte Probe für die biologische Charakterisierung bereitstellen können8,14,15. Beispielsweise konnten Ang et al.8 SARS-CoV-2-RNA in 72 % der Proben nachweisen, die mit einem Trockenluftprobenehmer mit 150 l/min gesammelt wurden, während in Proben, die mit demselben Probenehmer bei 50 l/min in einer Isolationsstation für COVID-Patienten gesammelt wurden, kein Virus nachgewiesen wurde . Sie führten die höhere Probenerkennung auf eine bessere Virusrückgewinnung bei höheren Probenflussraten zurück. Darüber hinaus haben aktuelle Studien die Anwendung von PILS mit hoher Durchflussrate gezeigt, um mit Krankheitserregern beladene Aerosole direkt in einer flüssigen Lösung zu sammeln und mithilfe von Echtzeit-Virusdetektoren16 oder Offline8,14,17,18 Techniken zu quantifizieren. Während bei der Entwicklung von High-Flow-PILS-Geräten erhebliche Fortschritte erzielt wurden, integrieren nur sehr wenige Studien das PILS mit Echtzeitsensoren zur Virenerkennung16.

Biosensoren erfreuen sich in letzter Zeit zunehmender Beliebtheit als vielversprechende, kostengünstige Alternative zur RT-qPCR zum Nachweis von SARS-CoV-2, da sie kostengünstig, schnell, empfindlich und hochspezifisch sind19,20. Immunosensoren sind auf Affinitätsliganden basierende Biosensoren, bei denen eine immunchemische Reaktion verschiedene Arten von Signalen (optisch, elektrochemisch, thermometrisch oder mikrogravimetrisch) erzeugt, wenn sie an ein bestimmtes Ziel binden, wodurch sie das Vorhandensein ausgewählter Krankheitserreger in niedrigen Konzentrationen erkennen können21,22. Mehrere Studien haben die Anwendung von Biosensoren zum Nachweis von SARS-CoV-2 in Nasenabstrichen23,24, Speichel20 und ausgeatmeten Atemkondensatproben25 erfolgreich demonstriert und im Vergleich zur RT-qPCR ähnliche oder bessere Ergebnisse erzielt. Es gibt jedoch keine von Experten überprüften Studien, in denen Biosensoren zum Nachweis von SARS-CoV-2 in der Luft eingesetzt wurden.

Hier präsentieren wir einen Monitor für die Luftqualität von Krankheitserregern (pAQ), der einen maßgeschneiderten Hochdurchfluss-Nasswandzyklon-PILS vom Batch-Typ mit einem von Lamas abgeleiteten Nanokörper koppelt, der gegen das SARS-CoV-2-Spike-Protein gerichtet ist und kovalent an ein Mikromolekül gebunden ist. Immunelektroden-Biosensor (MIE) zur nahezu Echtzeiterkennung von SARS-CoV-2 in der Luft mit einer Zeitauflösung von 5 Minuten. Die MIE-Technologie wurde von einem elektrochemischen Biosensor übernommen, der zum Nachweis von Amyloid-β bei der Alzheimer-Krankheit verwendet wird26,27,28. Mit Viren beladene Aerosole werden direkt aus der Luft auf ein flüssiges Sammelmedium im Nasszyklon gesammelt und an die MIE-Biosensoreinheit übertragen, die das Vorhandensein von Viren innerhalb von 30 Sekunden erkennt und meldet. Die Leistung des Nasszyklons wurde mit anderen kommerziell erhältlichen PILS mit geringem Durchfluss verglichen. Die Leistung und Empfindlichkeit des pAQ-Monitors wurden im Labor anhand mehrerer inaktivierter SARS-CoV-2-Virusvarianten validiert.

Der pAQ-Monitor besteht aus einem diskontinuierlichen Nasswand-Glaszyklon (im Folgenden als Nasszyklon bezeichnet), der mit einer MIE-Erkennungseinheit gekoppelt ist, die eine automatisierte Flüssigkeitshandhabungseinheit und eine MIE-Biosensorbaugruppe beherbergt (Abb. 1). Der Nasszyklon (ergänzende Abbildung 1) ist an eine Vakuumpumpe mit hohem Durchfluss (Fein Power Tools, PA, USA) angeschlossen, um Luft mit ~ 1.000 (± 10 %) lpm zu entnehmen. Vor der Luftprobenahme wird der Zyklon mit einem vordefinierten Volumen (~15 ml) phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gefüllt. Der Druckabfall saugt schnell Umgebungsluft durch einen tangentialen Einlass an und erzeugt einen Wirbel, der einen rotierenden Film aus PBS-Flüssigkeit an der Innenwand des Zyklons erzeugt29. In den Nasszyklon eindringende Aerosole prallen auf die benetzten Innenwände und werden im flüssigen Medium gesammelt. Aerosole, die nicht vom Nasszyklon aufgefangen werden, treten oben aus und werden von einem hocheffizienten Partikelabsorptionsfilter (HEPA) aufgefangen. Es werden 5 Minuten lang Luftproben entnommen, anschließend wird die konzentrierte Aerosol- und PBS-Lösung zur MIE-Detektionseinheit übertragen.

ein Schema des pAQ-Monitors, das den Nasszyklon PILS in Verbindung mit der MIE-Erkennungseinheit zeigt, bestehend aus einem eingetauchten MIE-Biosensor, der mit einem Potentiostat und automatisiertem Liquid-Handling-Zubehör verbunden ist, und b 3D-Darstellung des vorgeschlagenen pAQ-Monitors.

Die Detektionseinheit besteht aus einem untergetauchten Biosensor, der an einen Potentiostat angeschlossen ist, peristaltischen Pumpen für den Flüssigkeitstransfer, einem Mikrocomputer, Reagenzbehältern, die mit hypochloriger Säure (HOCl), PBS und einer darin verdünnten 1 %igen Rinderserumalbuminlösung (BSA) gefüllt sind PBS zur Sensorkalibrierung. Der Biosensor verwendet siebgedruckte Kohlenstoffelektroden zum Nachweis des Vorhandenseins von Virusaerosolen basierend auf der im Cirrito-Laboratorium entwickelten MIE-Technik26, 27. Zum Nachweis von SARS-CoV-2-Virionen wird ein aus Lamas stammender Nanokörper kovalent an die Elektrodenoberfläche gebunden30, 31. Es erkennt die Oxidation von Tyrosin-Aminosäuren, die im Spike-Protein von SARS-CoV-2 vorhanden sind (siehe ergänzende Methode 2). Die SPCEs werden mit PBS vorbehandelt und die Oberfläche wird in einer Lösung von 1 % BSA vorblockiert, um die Bindung unspezifischer elektroaktiver Spezies zu vermeiden. Der MIE-Biosensor wird an einen Potentiostat (PalmSens BV, Niederlande) angeschlossen und die Rechteckwellenvoltammetrie (SWV) wird in Blind- und Probenlösungen durchgeführt. Die angelegte Spannung wird mit einer Frequenz von 15 Hz schrittweise von 0 auf 1 V erhöht. Bei ~0,65 V wird das Tyrosin im SARS-CoV-2-Spike (S)-Protein oxidiert und vom MIE als Spitzenoxidationsstrom erkannt. Die Größe des Spitzenoxidationsstroms bei ~0,65 V gibt die Konzentration des Virus in jeder Testprobe an (siehe ergänzende Methode 3).

Die größenabhängige Partikelrückgewinnung innerhalb des im pAQ-Monitor verwendeten Nasszyklons wurde zunächst mithilfe von CFD-Simulationen berechnet (ergänzende Abbildung 2). Die Ergebnisse des CFD-Modells zeigen, dass der Nasszyklon eine Sammeleffizienz von >95 % für Partikel >1 μm und einen Grenzdurchmesser (wobei die Sammeleffizienz 50 % beträgt) von 0,4 μm aufweist.

Anschließend wurde die Leistung der Nasszyklonvirus-Probenahme experimentell mit zwei kommerziell erhältlichen PILS verglichen: einem BioSampler® (SKC Inc., USA)32 und einem Liquid Spot Sampler™ (LSS; Aerosol Devices, USA)33. Die PILS-Vergleichsexperimente wurden durchgeführt, indem der inaktivierte Washington-Stamm (WA-1) des SARS-CoV-2-Virus in einer gut gemischten, versiegelten 21-m3-Testkammer aus rostfreiem Stahl in Aerosolform gebracht wurde (ergänzende Abbildung 4). Die Instrumente wurden so eingestellt, dass sie gleichzeitig 10 Minuten lang die Luft in der Kammer messen konnten. Beachten Sie, dass der Nasszyklon mit hohem Durchfluss zwar weniger als 5 Minuten Probenentnahme für den Virusnachweis erfordert, wir die Kammerexperimente jedoch 10 Minuten lang durchgeführt haben, um sicherzustellen, dass im BioSampler® und im LSS eine ausreichende Viruskonzentration für die RT-qPCR-Analyse gesammelt wurde. Nach der Probenahme wurde das in jedem Gerät gesammelte Virus mithilfe von RT-qPCR quantifiziert. Um den Einfluss der anfänglichen Viruskonzentration auf die Probenahmeleistung zu untersuchen, führten wir die Kammerexperimente bei drei Virusbeladungsbedingungen durch: <500 Kopien/m3 („niedrig“), 500–10.000 Kopien/m3 („mittel“) und >10.000 Kopien /m3 („hoch“). Alle Experimente wurden entweder in doppelter oder dreifacher Ausführung durchgeführt. Eine detaillierte Beschreibung des Versuchsaufbaus und -protokolls finden Sie in der ergänzenden Methode 5.

Abbildung 2a vergleicht die Virusrückgewinnung des Nasszyklons mit dem BioSampler® und LSS in einer versiegelten Kammer bei niedrigen, mittleren und hohen aerosolisierten WA-1-Konzentrationen. Nach 10-minütiger Probenahme war die vom Nasszyklon gemessene virale RNA-Konzentration (d. h. RNA-Kopien/ml des Sammelmediums) im Durchschnitt etwa 10- bzw. etwa 50-mal höher als die im BioSampler® bzw. LSS gemessene Konzentration . Interessanterweise wurde die WA-1-RNA unter Bedingungen niedriger Konzentration nur im Nasszyklon gewonnen, wohingegen die im BioSampler® und LSS gesammelten Proben zu niedrig waren, um durch RT-qPCR quantifiziert zu werden. Die hohe RNA-Rückgewinnung durch den Nasszyklon lässt sich auf seine extrem hohe Durchflussrate zurückführen, die es ihm ermöglicht, im Vergleich zum BioSampler® (~0,125 m3) und LSS während der 10-minütigen Probennahme ein größeres Luftvolumen (~10 m3) zu beproben (~0,015 m3). Diese Eigenschaft macht den Nasszyklon ideal für den Einsatz in kontinuierlichen Überwachungsanwendungen mit hoher Zeitauflösung in realen Umgebungen wie Krankenhäusern und Patientenisolierräumen, wo die SARS-CoV-2-RNA-Konzentrationen in der Luft zwischen 2 und 94.000 Kopien/m3 variieren können ( Abb. 2b)9,34,35,36,37,38,39. Unter mittleren und hohen WA-1-Bedingungen war die vom Nasszyklon gemessene luftvolumennormalisierte RNA-Konzentration niedriger als die vom BioSampler® gemeldete Konzentration, aber höher oder ähnlich den vom LSS ermittelten Konzentrationen. Diese Ergebnisse stimmen mit den Erkenntnissen von Raynor et al. überein. 14, wo sie die Leistung von acht Luftkeimsammlern zum Sammeln von Influenzaviren testeten und zu dem Schluss kamen, dass Probennehmer mit hoher Durchflussrate (>200 l/min) die höchste Virusrückgewinnung aufwiesen und sich ideal für den Virennachweis in einer Umgebung mit niedrigen Viruskonzentrationen eigneten. Allerdings liefern Probenehmer mit geringer Durchflussrate (z. B. BioSampler®) eine genauere Schätzung der Viruskonzentration in der Luft. Ein ähnliches Ergebnis wurde auch von Luhung et al.40 gemeldet, wo sie die Auswirkung einer Erhöhung der Durchflussrate des Bioaerosol-Probenehmers (100 l/min bis 300 l/min) auf die Bioaerosol-Rückgewinnung untersuchten und zu dem Schluss kamen, dass die Luftprobenahme mit hohem Durchfluss die Zeitauflösung maximiert und verbessert Viruseinfangrate, insbesondere bei extrem niedrigen Bioaerosolkonzentrationen. Bei der Probenahme mit hohem Durchfluss kann es jedoch zu einer ungenauen Schätzung der Bioaerosolkonzentration pro Luftvolumeneinheit kommen. Die Unterschätzung der Virus-RNA-Konzentration durch den Nasszyklon in der Kammerstudie könnte auf Verdunstungsverluste, Partikelverlust an den Kammerwänden, Wiedereintragsverlust oder Partikelabprall zurückzuführen sein, die häufig bei der Probenahme von Nasszyklonen mit hohem Durchfluss beobachtet werden41,42.

a Kammerexperimente zum Vergleich der Nasszyklonleistung mit dem BioSampler® und LSS für drei aerosolisierte Viruskonzentrationsniveaus: <500 Kopien/m3 (niedrig; n = 3), 500–10.000 Kopien/m3 (mittel; n = 2) und > 10.000 Exemplare/m3 (hoch; n = 4). Die Daten werden als Mittelwert ± 1 SD von „n“ unabhängigen Experimenten dargestellt (b) typische Konzentration von SARS-CoV-2-RNA-Kopien, gemessen in der Raumluft; Die vertikalen gepunkteten Linien grenzen die Testwerte für niedrige, mittlere und hohe Viruskonzentrationen ab. c PCR-Ct-Wert (invertierte y-Achse) von Raumluftproben, die mit dem Nasszyklon in Wohnungen mit SARS-CoV-2-positiven Patienten (n = 7) und im Kontrollraum (n = 3) gesammelt wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± 1 SD von „n“ unabhängigen Stichproben dargestellt.

Wir haben die pAQ-Monitorbaugruppe zur Raumluftprobenahme in die Wohnungen von zwei SARS-CoV-2-positiven Patienten geschickt (ergänzende Methode 6). Alle sieben Luftproben, die mithilfe des Nasszyklons in den beiden von SARS-CoV-2-Patienten bewohnten Wohnungen gesammelt wurden, wurden anhand der RT-qPCR positiv getestet (Abb. 2c). Die RT-qPCR-Ergebnisse von Schlafzimmerproben wurden mit Luftproben verglichen, die in einem virenfreien Kontrollraum entnommen wurden. Die Ct-Werte der Luftproben aus den infizierten Haushalten lagen zwischen 32,7 und 34,9. Im Gegensatz dazu wurde in den Kontrollluftproben keine SARS-CoV-2-RNA nachgewiesen. Die in den Wohnungsluftproben im Vergleich zur Kontrollluft beobachteten deutlich niedrigeren Ct-Werte deuten auf das Vorhandensein von SARS-CoV-2-RNA in der Wohnungsluft hin. Beachten Sie, dass der hohe gemessene Ct-Wert (32,7–34,9) darauf hindeutet, dass die gesammelten Proben schwach SARS-CoV-2-positiv waren und eine sehr niedrige RNA-Konzentration aufwiesen (siehe ergänzende Methode 8), was darauf hindeutet, dass beide Freiwilligen, die sich selbst Es wurde berichtet, dass sie während des Probenahmezeitraums asymptomatisch waren. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit anderen Studien, die ebenfalls über ein geringes, aber statistisch signifikantes Vorkommen von SARS-CoV-2 in Isolationsräumen von COVID-Patienten berichteten, und unterstreichen die Bedeutung der Kontrolle der Luftübertragung des Virus5, 11.

Abbildung 3a zeigt die für die SARS-CoV-2-Variante spezifische LoD des pAQ-Monitors, berechnet für eine 5-minütige Luftprobenahme. Der pAQ-Monitor hat eine LoD von 35, 7, 9 und 23 RNA-Kopien/m3 Luft für die Stämme WA-1, Delta, Beta und BA-1. Die Variabilität in der LoD ist auf die SARS-CoV-2-Varianten-spezifischen Mutationen im Epitop der Spike-Protein-Rezeptor-Bindungsdomäne zurückzuführen, die an den Nanokörper bindet, was wahrscheinlich die Bindungseffizienz des Nanokörpers variiert und dadurch die Signalstärke des Biosensors verändert. Wie aus Abb. 3a und der ergänzenden Abb. 3 hervorgeht, reicht die Signalstärke des im pAQ-Monitor verwendeten MIE-Biosensors dennoch aus, um umweltrelevante Konzentrationen der vier getesteten SARS-CoV-2-Varianten zu erkennen, was seinen Einsatz als Umweltsensor unterstreicht SARS-CoV-2-Überwachungsgerät. Beachten Sie, dass diese Werte nur für Virusaerosole >1 μm gelten (~ 100 % Sammeleffizienz). Die LoD für das Virus in den Aerosolen im Submikronbereich variiert je nach der von der Partikelgröße des Nasszyklons abhängigen Rückgewinnungsfraktion (ergänzende Abbildung 2). Abb. 3b zeigt die Leistung des pAQ-Monitors bei der Probenahme von im Labor aerosolisiertem, inaktiviertem WA-1 und BA-1. Der pAQ-Monitor zeigte eine Sensitivität von 77 % für WA-1 und 83,3 % für BA-1. Die mit RT-qPCR gemessenen Konzentrationen von WA-1-Aerosolproben sind in der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt. Die Virusempfindlichkeit des pAQ ist vergleichbar mit der Empfindlichkeit anderer kürzlich entwickelter schneller Biosensoren (<10 Minuten Nachweiszeit), die zum Nachweis von Viren in verwendet werden Speichel43,44, Nasenabstriche45 und ausgeatmetes Atemkondensat25 Proben.

ein SARS-CoV-2-Varianten-spezifisches LoD. Die Daten werden als Mittelwert ± 2 SD von n = 3 unabhängigen Proben dargestellt. b Proof-of-Concept-Boxplot-Daten, die den Oxidationsstrom des pAQ-Monitors während der Probenahme von aerosolisiertem inaktiviertem WA-1 (Washington, n = 13) und BA-1 (Omicron, n = 6). Das Kästchen enthält das 25.–75. Perzentil der Messungen, die Mittellinie des Kästchens gibt den Mittelwert an und die Whiskers bezeichnen den minimalen und maximalen Oxidationsstrom, der aus „n“ unabhängigen Experimenten gemessen wurde.

Diese Studie demonstriert einen Proof-of-Concept-pAQ-Monitor, der durch die Kopplung eines auf einem Nasszyklon basierenden PILS mit einem hochempfindlichen MIE-Biosensor aufgebaut ist. Die Kammerexperimente und die Raumluftprobenentnahme in den Wohnungen zweier SARS-CoV-2-positiver Patienten belegen die hohe Vireneinfangeffizienz des Nasszyklons selbst in Umgebungen mit geringer Viruskonzentration. Die hohe Empfindlichkeit (77–83 %), die hohe Zeitauflösung (5 Min.), die niedrige LoD (7–35 RNA-Kopien/m3) und die Automatisierungsfähigkeit des pAQ-Monitors machen ihn zu einer idealen Wahl für einen erschwinglichen Preis (siehe ergänzende Diskussion 1). Echtzeiterkennung von Viren in verschiedenen Innenräumen wie Schulen, Wohnungen, Büros, Konferenzsälen und überfüllten öffentlichen Plätzen, wo die Echtzeitüberwachung von Viren (Längs- oder Stichprobenentnahme) es den Bewohnern ermöglichen würde, sofort Maßnahmen zur Vorbeugung oder Begrenzung zu ergreifen die Luftübertragung von SARS-CoV-2.

Eine Einschränkung des vorgeschlagenen pAQ-Monitors ist der hohe Geräuschpegel (75–80 dB) während des Gerätebetriebs, der sich negativ auf die Gesundheit und den Komfort der Bewohner eines Gebäudes auswirken kann. Derzeit wird daran gearbeitet, wirtschaftlich sinnvolle Lösungen zu finden, um den Geräuschpegel auf <65 dB zu senken, beispielsweise durch den Einsatz eines geräuscharmen Motors und die Schalldämmung der Außenseite des Geräts mithilfe einer Akustikauskleidung. Darüber hinaus arbeiten wir an der gleichzeitigen Erkennung anderer in der Luft befindlicher Krankheitserreger mithilfe des pAQ-Monitors durch Multiplexing von MIE-Biosensoren mit verschiedenen zielspezifischen Nanokörpern. Während die Ergebnisse dieser Studie die Eignung des pAQ-Monitors für reale Anwendungen belegen, bedarf das System noch weiterer Tests, um die Robustheit der Ergebnisse in verschiedenen Umgebungen mit unterschiedlichen Aerosolzusammensetzungen zu überprüfen. Zukünftige Arbeiten werden sich auf die umfassende Untersuchung potenzieller Störstoffe in der Luft konzentrieren, die die Leistung von Biosensoren beeinflussen könnten.

Vor jeder Probenmessung wird der Basiswert des Biosensors erfasst, indem 2 ml Kalibrierungslösung (dh 1 % BSA in PBS) in das MIE-Fläschchen überführt und eine Rechteckwellenvoltammetrie (SWV) durchgeführt wird. Anschließend werden 2 ml der Testaerosolprobe in das MIE-Fläschchen überführt und eine SWV durchgeführt, um die Höhe des Oxidationspeaks zu messen, die dem oxidierten Tyrosin im Viruspartikel entspricht. Die Tyrosinoxidation erfolgt bei ~0,65 V. Der von Lamas abgeleitete Nanokörper bietet Spezifität gegen das SARS-CoV-2-Spike-Protein. Die für jede Aerosoltestprobe gemessene Tyrosin-Oxidationspeakhöhe wird auf die Oxidationspeakhöhe normalisiert, die für die virenfreie Luftkontrolle erhalten wurde, um das Signal als positiven oder negativen Messwert zu klassifizieren. Nach 10 Probenahmezyklen werden etwa 15 ml HOCl zur Dekontamination in den Zyklon eingespritzt. Während das MIE eine Probe analysiert, beginnt der Nasszyklon parallel mit der Sammlung der nächsten Probe. Die ergänzenden Methoden 2 und 3 bieten eine Beschreibung der Biosensorvorbereitung und des schrittweisen Arbeitsablaufs des pAQ-Monitors. Eine 3D-Darstellung des vorgeschlagenen pAQ-Monitors, die mit dem Softwarepaket SolidWorks (Dassault Systèmes, Vélizy-Villacoublay, Frankreich) erstellt wurde, ist in Abb. 1b dargestellt.

Die Leistung des Nasszyklons wurde numerisch mithilfe einer CFD-Software (Computational Fluid Dynamics) (Ansys Fluent 2021 R1) bewertet. Die größenspezifische Partikelverfolgung innerhalb des Zyklons wurde mit der diskreten Phasenmethode Fluent durchgeführt. Die Flüssigkeitsströmung im Inneren des Zyklons wurde mit dem Reynold-Spannungsmodell46 simuliert. Die in der Simulation verwendeten Annahmen und Randbedingungen sind in der ergänzenden Methode 1 aufgeführt.

Die Nasszyklonbaugruppe (Zyklon, Vakuumpumpe und PBS-Lösung) wurde in die Wohnungen von zwei Freiwilligen geliefert, bei denen bestätigt wurde, dass sie SARS-CoV-2-positiv sind. Die Freiwilligen sammelten 5 Minuten lang Luftproben (n = 3 bis 4) aus dem Inneren ihrer Schlafzimmer/Wohnungen und lagerten sie dann in 15-ml-Zentrifugenröhrchen auf Eis. Anschließend wurden die flüssigen Proben in ein Labor transportiert und mittels RT-qPCR analysiert, um das Vorhandensein von SARS-CoV-2 nachzuweisen. Weitere Einzelheiten zum Probenahmeverfahren finden Sie in der ergänzenden Methode 6.

Die Nachweisgrenze (LoD) des pAQ-Monitors wird nach Gleichung berechnet. (1):

Die LoD des MIE-Biosensors wurde durch sequentielle Verdünnung einer reinen Stammlösung des inaktivierten Virus berechnet. Ein anfängliches Aliquot des Virus bekannter Konzentration wurde sequentiell verdünnt und der Oxidationsstrom (Iox) wurde basierend auf dem SWV gemessen. Die niedrigsten vom Biosensor erkannten Viruskonzentrationen betrugen 32, 8, 6 und 21 RNA-Kopien/ml für USA/WAa1/2020 (WA1), Beta (B.1.351), Delta (B.1.617.2) und Omicron ( BA.1) Stämme von SARS-CoV-2 (ergänzende Abbildung 3). Das Flüssigkeitsvolumen im Zyklon sinkt nach 5-minütiger Probenahme aufgrund der Verdunstung während der Probenahme (55–65 %). Für die LoD-Berechnung haben wir das im Nasszyklon verbleibende Volumen als Durchschnitt von 10 wiederholten 5-minütigen Probenahmeexperimenten genommen.

Die pAQ-Monitor-Empfindlichkeitsberechnung, die die Fehler aus der Probenentnahme des Nasszyklons und dem Biosensor-Erkennungsschritt berücksichtigt, wurde durch Zerstäubung von inaktiviertem WA-1 und BA-1 (Omicron-Stamm) mit einem Collison-Zerstäuber und 5-minütiger Probenahme mit dem Nasszyklon bestimmt (Ergänzende Methode 7). Die gesammelten Proben wurden dann manuell in zwei Teile geteilt, einer wurde mit dem Biosensor analysiert und der andere wurde mit RT-qPCR analysiert. Aufgrund logistischer Probleme wurde bei den BA-1-Proben keine RT-qPCR durchgeführt. Wir haben das Softwarepaket Origin Pro 2022 verwendet, um grundlegende deskriptive Statistiken durchzuführen und Abb. 2 und Abb. 3 zu erstellen.

SARS-CoV-2-Virus-RNA-Kopien in aerosolisierten Proben wurden durch RT-qPCR basierend auf der in Darling et al.47 beschriebenen Methode quantifiziert. RNA wurde aus 140 μl Proben mit dem QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) extrahiert und mit 60 μl Puffer AVE eluiert. 8,5 μl RNA wurden für Echtzeit-RT-qPCR zum Nachweis und zur Quantifizierung des N-Gens von SARS-CoV-2 mithilfe des TaqMan™ RNA-to-CT 1-Step Kit (Thermo Fisher Scientific) auf einem QuantStudio 12 K Flex Real-time verwendet Thermocycler (Applied Biosystems) unter Verwendung des Standard-Thermozyklusprogramms. Als Primer und Sonden wurden 2019-nCoV RUO Kit (IDT) verwendet. Virale RNA wurde als N-Gen-Kopienzahl pro ml ausgedrückt, basierend auf einem im Assay enthaltenen Standard, der durch In-vitro-Transkription eines synthetischen DNA-Moleküls erstellt wurde, das die Zielregion des N-Gens enthält. Dissoziationskurven wurden nach dem qPCR-Assay analysiert, um die Wirksamkeit des Primers zu bestätigen. Die relativen mRNA-Spiegel wurden mit der vergleichenden Ct-Methode unter Verwendung des ABI 12 K Flex Softwarepakets Version 1.3 berechnet. Die Umrechnung der Ct-Werte in das Volumen der normalisierten Konzentration der Probenluft erfolgt in der ergänzenden Methode 8.

Das Institutional Review Board der Washington University hielt die Genehmigung dieses Projekts für unnötig, da (1) die Studie keine Informationen über einen lebenden Menschen sammelte, (2) die Studie keine Interaktion oder Intervention mit einem lebenden Menschen zu Forschungszwecken beinhaltete, ( 3) Die Studie beinhaltete nicht die Erhebung oder Verwendung identifizierbarer, privater Informationen und (4) die Studie testete kein Gerät, das zur Diagnose oder Behandlung einer Krankheit entwickelt wurde. Die beiden Freiwilligen erteilten ihre Einverständniserklärung, Raumluftproben aus ihren Wohnungen zu sammeln und zu analysieren.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Quelldaten werden als „Source Data“-Datei bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Arbeit wurde durch das RADx-Rad-Programm der National Institutes of Health (NIH) unter U01 AA029331 und U01 AA029331-S1 (JRC, RKC und CMY), NIH, National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) Intramural Research Program, finanziert. die Uniformed Services University of the Health Sciences (DLB); NIH SARS-CoV-2 Assessment of Viral Evolution (SAVE) Program (ACMB) und WashU-IITB Joint Master's Program (JVP und AGM). Y2X Life Sciences hat die exklusive Option, diese Technologie für die Kommerzialisierung zu lizenzieren und wurde während der Designphase konsultiert. Der in dieser Studie verwendete Biosensor befindet sich noch im Forschungsstadium. Die entsprechenden Autoren können das Protokoll zum Aufbau und Betrieb des Biosensors interessierten akademischen, nichtkommerziellen Gruppen auf schriftliche Anfrage zur nichtkommerziellen akademischen Forschungsnutzung zur Verfügung stellen. Die in dieser Präsentation geäußerten Ansichten sind die der Autoren und spiegeln nicht die offizielle Politik oder Position der Uniformed Services University, der US-Armee, des Verteidigungsministeriums oder der US-Regierung wider.

Nishit J. Shetty

Aktuelle Adresse: Civil and Environmental Engineering, Virginia Tech, Blacksburg, VA, 24061, USA

Zentrum für Aerosolwissenschaft und -technik, Abteilung für Energie-, Umwelt- und Chemieingenieurwesen, Washington University in St. Louis, St. Louis, MO, 63130, USA

Joseph V. Puthussery, Dishit P. Ghumra, Benjamin J. Sumlin, Amirhossein Sarabandi, Anushka Garg Mandal, Nishit J. Shetty und Rajan K. Chakrabarty

Abteilung für Neurologie, Hope Center for Neurological Disease, Knight Alzheimer's Disease Research Center, Washington University, St. Louis, MO, 63110, USA

Kevin R. McBrearty, Brookelyn M. Doherty, Woodrow D. Gardiner, Jordan P. Magrecki und John R. Cirrito

Abteilung für Chemieingenieurwesen, Indian Institute of Technology Bombay, Mumbai, 400076, Indien

Anushka Garg Mandal

National Institute of Neurological Disorders and Stroke, Bethesda, MD, USA

David L. Brody und Thomas J. Esparza

Abteilung für Neurologie, Uniformed Services University of the Health Sciences, Bethesda, MD, USA

David L. Brody

Medizinische Fakultät, Washington University, St. Louis, MO, 63110, USA

Traci L. Bricker & Adrianus CM Boon

Abteilungen Molekulare Mikrobiologie sowie Pathologie und Immunologie, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, USA

Adrianus CM Segen

Abteilung für Psychiatrie, Washington University School of Medicine, St. Louis, MO, 63110, USA

Carla M. Yuede

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JRC, RKC, CMY, JVP, BJS konzipierte Forschung; JVP, DPG, KRM, WDG, BMD, JPM, AS, AGM führten Recherchen und Datenanalysen durch. DLB, TJE, TLB und ACMB stellten Fachwissen und Anleitung bei der Versuchsplanung und Probenbeschaffung zur Verfügung. JVP, DPG und RKC haben den Artikel mit Beiträgen von JRC, CMY, BJS und NJS verfasst

Korrespondenz mit Carla M. Yuede, John R. Cirrito oder Rajan K. Chakrabarty.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Eine Peer-Review-Datei ist verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die Originalautor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Puthussery, JV, Ghumra, DP, McBrearty, KR et al. Echtzeit-Umweltüberwachung von SARS-CoV-2-Aerosolen. Nat Commun 14, 3692 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39419-z

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Eingegangen: 28. Februar 2023

Angenommen: 12. Juni 2023

Veröffentlicht: 10. Juli 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39419-z

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